單端測(cè)序和雙端測(cè)序

單端測(cè)序只有一個(gè)測(cè)序引物，所以PCR只能沿著這個(gè)引物的方向進(jìn)行，所有的reads只能在一個(gè)方向上讀取。但是，測(cè)序的質(zhì)量會(huì)隨著測(cè)序的進(jìn)行而下降，因此隨著測(cè)序的進(jìn)行，reads會(huì)更加不準(zhǔn)確。一種解決方案是雙端測(cè)序。對(duì)于500 bp的序列，單端測(cè)序的下游質(zhì)量會(huì)很差，但是從兩個(gè)方向測(cè)量250 bp-300 bp，然后將它們拼接在一起可以大大提高測(cè)序。準(zhǔn)確率。雙端測(cè)序接頭的序列更復(fù)雜。首先，要分別進(jìn)行兩個(gè)方向的測(cè)序，需要兩個(gè)不同方向的測(cè)序引物（下圖中的Rd1 SP和Rd2 SP）；其次，為了區(qū)分兩個(gè)方向的reads，

雙端測(cè)序中每個(gè)單獨(dú)的Read的長(zhǎng)度是整個(gè)待測(cè)序列的一半以上，因此可以根據(jù)兩個(gè)Reads的重疊部分進(jìn)行拼接

為什么會(huì)有雙端這樣的技術(shù)發(fā)明？

①假設(shè)一個(gè)DNA片段剛好跨越了重復(fù)序列區(qū)（下圖左側(cè)）和唯一序列區(qū)（下圖右側(cè)）。如果只讀取Single-Read，只會(huì)得到紅色實(shí)線的串口信息，即ATATTATAT。接下來(lái)，當(dāng)我們想要將這個(gè)read與參考基因組進(jìn)行比較時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)問(wèn)題：這個(gè)read是來(lái)自紅色實(shí)線的位置還是紅色虛線的位置？我們可以使用 Paired-end 技術(shù)來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。由于Paired-end read之間的距離是已知的（這里我們?cè)O(shè)置為34bp），我們可以先定位綠色read的位置，正確定位左邊紅色read之間的AT位置，不要誤會(huì)。在紅色虛線位置判斷。如下所示：

②由于單端測(cè)量的錯(cuò)誤率太長(zhǎng)，錯(cuò)誤率會(huì)增加，像第一代測(cè)序一樣，可以測(cè)量幾百個(gè)bp的長(zhǎng)度，但序列越晚，條帶越混雜，不清楚。二代測(cè)序也是如此。, 600bp 的單端測(cè)量會(huì)很不準(zhǔn)確，雙端 300bp 測(cè)序會(huì)準(zhǔn)確得多。

路口

序列可能有 4 到 500 bp 長(zhǎng)，每邊有 120-150 bp。結(jié)點(diǎn)是雙端測(cè)序中間未檢測(cè)到的區(qū)域。

基因豐度和基因表達(dá)豐度

基因豐度是指基因組中基因的拷貝數(shù)。基因豐度高，也就是這個(gè)基因的數(shù)量多，那么這個(gè)基因的表達(dá)量也可能高，但不一定，主要看基因啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。因此，高基因豐度并不意味著高表達(dá)豐度。

高基因表達(dá)豐度意味著基因轉(zhuǎn)錄成更多的mRNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯的模板都相同，進(jìn)而表達(dá)更多的蛋白質(zhì)，對(duì)表型的影響更大。

成績(jī)單

轉(zhuǎn)錄本是一種或多種成熟的mRNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯的模板都相同，可以編碼基因轉(zhuǎn)錄形成的蛋白質(zhì)，一個(gè)基因可以通過(guò)不同的內(nèi)含子剪接形成不同的轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄組由許多轉(zhuǎn)錄本組裝而成。

RNA和DNA測(cè)序的區(qū)別

測(cè)序深度和測(cè)序覆蓋率

對(duì)長(zhǎng)度為100bp的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序：采用單端測(cè)序，每個(gè)read長(zhǎng)度為5bp；共獲得 200 個(gè)讀數(shù)；所有reads與target region進(jìn)行比較后，100bp的target region中至少有1個(gè)位置98bp的位置被1個(gè)read覆蓋，也就是說(shuō)剩下的2bp沒(méi)有被1個(gè)read覆蓋。

深度：200 x 5/100 = 10 我們說(shuō)這個(gè)排序的深度是 10X。

覆蓋率：98/100 × 100% = 98% 我們說(shuō)這個(gè)測(cè)序的覆蓋率是98%

測(cè)序深度越高，基因覆蓋率越高。當(dāng)普通人的測(cè)序深度達(dá)到10x時(shí)，基因覆蓋率為100%，測(cè)序深度飽和，增加測(cè)序深度沒(méi)有效果。

刀片尺寸

通過(guò)檢測(cè)雙端測(cè)序的起始和終止位置，可以得到插入片段的長(zhǎng)度，從而決定了測(cè)序的長(zhǎng)度。

引物和適配器

提取基因組DNA后，通過(guò)超聲或酶切中斷，然后跑膠，得到300-500 bp的小片段。因?yàn)榇驍嗍请S機(jī)打斷的，可能會(huì)有粘端，所以要用酶來(lái)形成平端。在平端后加入A堿基得到粘端，將接頭加入流通池，進(jìn)行幾輪PCR擴(kuò)增得到測(cè)序文庫(kù)。接頭由三部分組成，依次是與流動(dòng)池結(jié)合的寡聚體、樣品索引和測(cè)序所需的引物預(yù)聚體。

測(cè)序時(shí)，先將測(cè)序引物與序列結(jié)合，然后邊合成邊進(jìn)行測(cè)序（接一個(gè)堿基，測(cè)一次，然后進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，接上堿基，再測(cè)序，如此循環(huán)下去），然后測(cè)量長(zhǎng)度。, 去掉合成的序列，再加入一個(gè)premer來(lái)測(cè)index，讓每個(gè)read都有一個(gè)index（用來(lái)識(shí)別樣品的來(lái)源），然后進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，去掉已經(jīng)被測(cè)的序列chain，然后再次測(cè)序。

需要注意的一點(diǎn)是，當(dāng)插入的序列（即被超聲打斷的小片段）比較短，或者文庫(kù)的插入片段短于序列的read長(zhǎng)度時(shí)，可能會(huì)測(cè)到premer和index，所以在獲取到數(shù)據(jù)之后，就要去聯(lián)合了。

索引：每個(gè)樣本被索引修改，得到的reads也包含索引。根據(jù)索引可以知道雙端測(cè)序是否來(lái)自同一個(gè)樣本。

特定鏈庫(kù)

正鏈/負(fù)鏈：對(duì)于基因來(lái)說(shuō)，兩條DNA鏈之一作為RNA合成的模板。這條鏈稱(chēng)為負(fù)鏈（模板鏈/反義鏈），另一條稱(chēng)為正鏈（非模板鏈/正義鏈）。

反義鏈/有義鏈：在雙鏈DNA中，用于轉(zhuǎn)錄mRNA的DNA鏈稱(chēng)為模板鏈，不用于轉(zhuǎn)錄的鏈稱(chēng)為非模板鏈。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，轉(zhuǎn)錄的mRNA鏈的堿基序列與非模板鏈的堿基序列相同。唯一的區(qū)別是非模板鏈中的T被mRNA鏈中的U取代，因此非模板鏈也稱(chēng)為編碼鏈或有義鏈。

鏈特異性：鏈特異性構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)，可以確定轉(zhuǎn)錄物是來(lái)自正鏈還是負(fù)鏈。以獲得更準(zhǔn)確的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)信息。并且可以更好地發(fā)現(xiàn)新基因。（研究表明，許多基因組區(qū)域都有轉(zhuǎn)錄的正鏈和負(fù)鏈。反義轉(zhuǎn)錄是真核基因的一個(gè)特征，也是一種重要的調(diào)控方式。對(duì)于原核和低等真核生物的基因組，往往存在重疊基因。

為什么Illumina限制了合成鏈的長(zhǎng)度，不能像Sanger法那樣長(zhǎng)到1k？

原因在于二代測(cè)序的額外PCR過(guò)程：每個(gè)位點(diǎn)都要進(jìn)行多次測(cè)試。例如，一段時(shí)間后通過(guò)PCR得到的每個(gè)簇包含200個(gè)相同的序列，因此需要檢查這200個(gè)序列。序列的相同位點(diǎn)被測(cè)序。

在第一輪中，我們將測(cè)試第一個(gè)位置（假設(shè)位置 1 是 A）。正常情況下，200個(gè)序列應(yīng)該加A堿基，可惜只有199個(gè)在1位加了A堿基。1個(gè)序列沒(méi)加，所以有199個(gè)紅色和1個(gè)灰色【當(dāng)然還是沒(méi)有影響】；

第二輪（假設(shè)位置2為G），每個(gè)人都要加G來(lái)測(cè)量果嶺，但是前一個(gè)沒(méi)有加A，而且他要彌補(bǔ)之前的錯(cuò)誤，所以在給其他序列加G的時(shí)候，就加了加了上次應(yīng)該加的A，就變紅了。這種紅色在一大群綠色中以噪音的形式存在。依次向下，測(cè)序長(zhǎng)度越長(zhǎng)，噪聲信號(hào)越多，標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)和噪聲信號(hào)可能各減半。這樣系統(tǒng)就無(wú)法判斷，只能給出N，如果N太多，后續(xù)的分析處理就會(huì)很麻煩。去丟數(shù)據(jù)，不去，又是多余的。

基因注釋

① RefSeq 基因注釋?zhuān)粊?lái)自 NCBI，注釋基因的不同轉(zhuǎn)錄本。一個(gè)轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)一個(gè)數(shù)字并成為 RefSeq id。例如，可以翻譯成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本會(huì)以NM_開(kāi)頭，例如NM_015658；對(duì)于不可翻譯的成績(jī)單，的成績(jī)單，會(huì)以NR_開(kāi)頭，比如NR_027055；不同注解的情況如下圖（ps：注解庫(kù)來(lái)源不同，數(shù)量不同）

②Ensembl annotation：對(duì)基因的不同轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋。以 ENSG 開(kāi)頭的 Ensembl gene_id 表示 Ensembl gene_id，例如 ENSG，Ensembl 轉(zhuǎn)錄本 id 以 ENST 開(kāi)頭表示 Ensembl 轉(zhuǎn)錄本 id，例如 ENST。

③ UCSC 基因注釋?zhuān)簩?duì)基因的不同轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋?zhuān)ǔＣQ(chēng)類(lèi)似于uc004cpf。

反向互補(bǔ)序列的含義

生物DNA序列有兩條鏈。雖然網(wǎng)站在查看基因組序列時(shí)一般都會(huì)提供正向鏈，但不同基因在基因組序列中的轉(zhuǎn)錄起始方向是不同的。有的基因在等待，有的則是停留在相反的方向。當(dāng)需要查看轉(zhuǎn)錄方向與正向鏈相反的基因的序列時(shí)，如果要查找該基因的啟動(dòng)子（ATG），則需要查看正向鏈的反向互補(bǔ)序列。

此外，從基因組中擴(kuò)增序列時(shí)，需要同時(shí)設(shè)計(jì)兩條鏈的引物。這時(shí)候還需要正向序列和反向互補(bǔ)序列。

有許多基因調(diào)控同時(shí)作用于兩條鏈。反向互補(bǔ)序列是根據(jù)另一條鏈的信息計(jì)算一條鏈的信息。

軌跡

基因座可以是基因、基因的一部分，也可以是具有一定調(diào)控作用的DNA序列。基因座是染色體上的固定位置，編碼相同基因座的相同DNA稱(chēng)為等位基因。同一基因座的相同等位基因是純合子，同一基因座的不同等位基因是雜合子。

基因異構(gòu)體

亞型/同種型可以理解為基因的不同形式，即同一基因座產(chǎn)生的mRNA。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）、編碼蛋白序列和非翻譯區(qū)存在差異。間接改變了基因的功能。

圖中1、2、3為mRNA的三個(gè)外顯子。由于連接方法不同，產(chǎn)生了三種同工型。

基因異構(gòu)體

可變剪切

大多數(shù)真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA前體，一般都是以一種方式剪接產(chǎn)生一種mRNA，結(jié)果只產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)。然而，一些基因產(chǎn)生的mRNA前體可以通過(guò)不同的方式拼接產(chǎn)生兩種以上的mRNA。

編碼蛋白質(zhì)的成熟 mRNA 是已剪接的前體 mRNA。外顯子可以按其線性順序拼接，內(nèi)含子可以保留而不被切除。因此，成熟mRNA中不一定存在每個(gè)外顯子和內(nèi)含子。

有5種類(lèi)型：外顯子跳躍、內(nèi)含子保留、3、 5'端可變剪接、3'端可變剪接、特定外顯子可變剪接（如第一個(gè)或*后一個(gè)外顯子）。

普通翻譯

外顯子跳躍

3'可變剪裁

5'可變剪裁

分析的障礙

（1）衡量標(biāo)準(zhǔn)：為了比較誰(shuí)多誰(shuí)少，一般采用相對(duì)定量的分析方法。但是，相同的絕對(duì)量對(duì)于不同的基數(shù)會(huì)有不同的相對(duì)值。例如，第一次A和B基因在第二次測(cè)量中的表達(dá)水平為10，那么此時(shí)A基因的豐度為10/(10+10）=50%；A、B、C的表達(dá)量在第二次測(cè)量中是 10 ，那么這次A的豐度變成了33.3%，但是能不能說(shuō)第二次A基因表達(dá)的豐度比第一次低呢？所以，只看表面數(shù)字，并不能反映實(shí)際問(wèn)題。

（2）測(cè)量方法：目前用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的二代測(cè)序仍然測(cè)量一小部分DNA。由于可變剪切，一般都會(huì)去除內(nèi)含子，拼接不同的外顯子，但畢竟它們“同門(mén)研究”，所以得到的成績(jī)單是相似的，就像由1、2組成的成績(jī)單a和由1、3組成的成績(jī)單b都包含3，所以你必須是更多很難將一個(gè)短段落與原始抄本進(jìn)行比較（例如，如果一個(gè)閱讀滿(mǎn)足 3 的一小部分，那么這個(gè)閱讀屬于抄本 a 還是抄本 b？）

（3）測(cè)量對(duì)象：mRNA不如DNA穩(wěn)定，容易降解，因此其豐度一直在變化。因此，測(cè)量轉(zhuǎn)錄組之前需要這個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)，以確保觀察到變化，而這個(gè)變化與實(shí)驗(yàn)條件是相關(guān)的。一般來(lái)說(shuō)，為了證明這一點(diǎn)，需要對(duì)處于一種狀態(tài)的樣品進(jìn)行多次測(cè)量，即做的重復(fù)。差異基因的測(cè)定還必須通過(guò)duplication，即在一個(gè)條件下多次重復(fù)得到的值，標(biāo)準(zhǔn)條件下多次重復(fù)的值存在差異，所以認(rèn)為這個(gè)差異基因是有效的。建議至少設(shè)置3次重復(fù)，并且五更好。

切感對(duì)比

有許多測(cè)序讀數(shù)來(lái)自?xún)蓚€(gè)外顯子的連接處（即剪接位點(diǎn)）。如果要比較參考基因組，則必須在讀數(shù)中間添加一個(gè)缺口（即原始內(nèi)含子）。就相當(dāng)于原來(lái)的reads踩著兩條船，現(xiàn)在兩條船要回家了，reads的腿要開(kāi)始裂了。因此，比較軟件必須考慮到這一點(diǎn)，并在讀取比較中間允許較大的間隙。

批量效果

對(duì)不同芯片、不同測(cè)序儀、不同測(cè)序通道或不同時(shí)間點(diǎn)采集的mRNA進(jìn)行測(cè)序，即使是相同的mRNA也會(huì)導(dǎo)致測(cè)序得到的基因表達(dá)量存在較大差異，這就是批量效應(yīng)。

短讀長(zhǎng)：測(cè)序得到的*大讀長(zhǎng)為500 bp，常見(jiàn)的序列片段長(zhǎng)度為100-300 bp。

Long-read long read length：測(cè)序得到的reads超過(guò)1000bp，代表全長(zhǎng)或接近全長(zhǎng)的mRNA。

直接 RNA 測(cè)序 (dRNA-seq)：一種直接對(duì) RNA 而非 cDNA 進(jìn)行測(cè)序的測(cè)序技術(shù)。它通常用于對(duì)全長(zhǎng)或接近全長(zhǎng)的 mRNA 進(jìn)行測(cè)序。

多映射讀數(shù)：從轉(zhuǎn)錄組的同源區(qū)域測(cè)序的讀數(shù)不能準(zhǔn)確確認(rèn)轉(zhuǎn)錄本或基因組的來(lái)源。

Synthetic long read：Synthetic long read：一種通過(guò)組裝多個(gè)短讀獲得長(zhǎng)讀的方法。

唯一分子標(biāo)識(shí)符 (UMI)：在擴(kuò)增前構(gòu)建 RNA-seq 文庫(kù)時(shí)添加的短序列或條形碼。理想情況下，每個(gè)轉(zhuǎn)錄本都與一個(gè)唯一標(biāo)識(shí)符相結(jié)合。包含此標(biāo)識(shí)符的讀數(shù)來(lái)自此轉(zhuǎn)錄本僅在定量期間計(jì)算一次?？捎糜诮档蚏NA-seq的數(shù)量偏好，特別適用于低初始RNA的單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

讀取長(zhǎng)度：?jiǎn)蝹€(gè)測(cè)序讀取的長(zhǎng)度。短讀長(zhǎng)RNA測(cè)序得到的長(zhǎng)度通常為50-150 bp。

靈敏度：將檢測(cè)到樣本中轉(zhuǎn)錄物的百分比，靈敏度越高，比率越高。它受樣品處理、文庫(kù)制備、測(cè)序和計(jì)算偏好的影響。

特異性：一種測(cè)量被正確識(shí)別的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本比例的方法，受樣品處理、文庫(kù)制備、測(cè)序和計(jì)算偏好的影響。

重復(fù)率 重復(fù)率：與轉(zhuǎn)錄組中相同位置對(duì)齊的測(cè)序讀數(shù)的比率。在 RNA-seq 文庫(kù)中，一些轉(zhuǎn)錄本可能具有高重復(fù)率，因?yàn)樗鼈冊(cè)跇颖局械谋磉_(dá)水平很高。高表達(dá)的基因具有高重復(fù)率，而低表達(dá)的基因可能具有*小的重復(fù)率。因此，RNA-seq 面臨著挑戰(zhàn)。該技術(shù)中的大多數(shù)重復(fù)可能是來(lái)自高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的真實(shí)信號(hào)，而其他重復(fù)則是由于擴(kuò)增和測(cè)序偏好。

生物重復(fù)：多次檢測(cè)不同生物來(lái)源的樣本，如三個(gè)個(gè)體的組織，用于捕捉生物個(gè)體自身的變化；這種變化要么是要研究的對(duì)象，要么是噪音。相比之下，技術(shù)重復(fù)是對(duì)同一樣本的重復(fù)操作——例如，對(duì)一個(gè)組織進(jìn)行三種處理。

摻入對(duì)照內(nèi)參：以特定濃度添加到樣品中的外源核酸文庫(kù)。它們通常是不同濃度的預(yù)合成 RNA，用于監(jiān)測(cè)反應(yīng)效率和技術(shù)方法偏差以及假陰性結(jié)果。

Translatome 翻譯組：在細(xì)胞、組織或生物體中被翻譯成蛋白質(zhì)的 mRNA 的集合。

結(jié)構(gòu)組結(jié)構(gòu)組：細(xì)胞、組織或生物體中 RNA 的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的集合。

Interactome 相互作用組：細(xì)胞、組織和生物體中分子相互作用的集合，包括 RNA-RNA 或 RNA-蛋白質(zhì)相互作用。