免疫共沉淀概述

相關(guān)服務(wù)：Co-IP蛋白相互作用檢測服務(wù)

免疫共沉淀 (Co-IP) 是基于抗原和抗體之間的特異性相互作用研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。免疫共沉淀可用于檢測兩種已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，或使用已知蛋白質(zhì)尋找與其相互作用的未知蛋白質(zhì)。與其他分子間相互作用檢測方法（GST pull down等）相比，免疫共沉淀實驗的優(yōu)點是蛋白質(zhì)結(jié)合是在細(xì)胞內(nèi)完成的，可以反映蛋白質(zhì)在自然狀態(tài)下的相互作用生物中翻譯蛋白質(zhì)中誰作為模板，結(jié)果更真實可靠。

實驗原理

當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下裂解時，完整細(xì)胞中的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用得以保留。如果細(xì)胞中存在XY蛋白復(fù)合物，用X（X也稱為誘餌蛋白）抗體X進(jìn)行免疫沉淀，則體內(nèi)與X結(jié)合的蛋白Y（Y也稱為靶蛋白）也沉淀出來。因此，將X的抗體加入細(xì)胞裂解液中以沉淀蛋白X，然后使用蛋白質(zhì)印跡（WB）檢測沉淀物中蛋白Y的存在。如果有，則說明細(xì)胞內(nèi)存在XY蛋白復(fù)合物，即XY蛋白相互影響。

Co-IP實驗過程

免疫沉淀實驗流程為：采集蛋白樣品-誘餌蛋白抗體沉淀誘餌蛋白-SDS-PAGE蛋白分離-WB檢測目的蛋白的存在。詳細(xì)的實驗操作流程請到《免疫共沉淀實驗操作流程及注意事項》查看。

收集蛋白質(zhì)樣本

蛋白質(zhì)樣品通常通過裂解細(xì)胞獲得。Co-IP實驗通常有兩種，一種是內(nèi)源性蛋白質(zhì)相互作用驗證，另一種是非內(nèi)源性蛋白質(zhì)相互作用驗證。內(nèi)源性相互作用是指細(xì)胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，即通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染將兩種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染到同一個細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)完成后，收集細(xì)胞并裂解獲得蛋白質(zhì)樣品。非內(nèi)源性相互作用 兩種蛋白的相互作用發(fā)生在細(xì)胞外，即含有目的蛋白的動植物組織器官經(jīng)過預(yù)處理和細(xì)胞裂解得到細(xì)胞裂解液，

沉淀誘餌蛋白

用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白：在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體，抗體會與誘餌蛋白結(jié)合。用磁鐵將磁珠拉下來，誘餌蛋白會一起沉淀。如果有目標(biāo)蛋白與誘餌蛋白相互作用，也會沉淀。如果沒有針對誘餌蛋白的特異性抗體，可以對誘餌蛋白（Myc、HA、Flag等）進(jìn)行標(biāo)記，然后使用標(biāo)記抗體沉淀蛋白。

SDS-PAGE 和 WB 檢測

得到沉淀后，需要驗證沉淀中是否存在相互作用的蛋白質(zhì)。先用SDS-PAGE分離蛋白復(fù)合物，然后用WB檢測目標(biāo)蛋白的存在（如果已知目標(biāo)蛋白的分子量，可以直接用SDS-PAGE檢測目標(biāo)蛋白的存在） ）。

實驗控制設(shè)置

為了保證*終的結(jié)果是自然狀態(tài)下的交互，而不是某些方面造成的人為交互（即“誤報”），在Co-IP的實驗設(shè)計過程中，需要設(shè)置正確的控制。

假設(shè)Co-IP實驗的實驗組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+靶蛋白Y”，可能出現(xiàn)的“假陽性”和需要設(shè)置的相應(yīng)實驗對照如圖所示下表：

可能的“誤報”需要設(shè)置對照實驗

磁珠和蛋白質(zhì) X 非特異性結(jié)合

“磁珠+抗體X+抗體Y”

磁珠與蛋白 Y 的非特異性結(jié)合

“磁珠+蛋白Y”

抗 X 抗體和 Y 非特異性結(jié)合

“磁珠+抗體X+蛋白Y”

抗 X 抗體（或磁珠）將與細(xì)胞裂解物中的其他蛋白質(zhì)結(jié)合

“磁珠 + 抗體 X + 宿主細(xì)胞裂解物生物中翻譯蛋白質(zhì)中誰作為模板，無需質(zhì)粒轉(zhuǎn)染”

抗體的非特異性結(jié)合

“正常 IgG+蛋白 X+蛋白 Y”

上述為避免“假陽性”的對照稱為陰性對照。除Co-IP實驗外，還將設(shè)立陽性對照組（Input group）。Input 組直接使用抗體 X（抗體 Y）進(jìn)行細(xì)胞裂解。執(zhí)行 WB 測試以驗證細(xì)胞裂解物中是否存在蛋白質(zhì) X（抗體 Y）。

在一些Co-IP實驗中，實驗者會對IP后的上清液進(jìn)行蛋白X和蛋白Y的WB檢測，這個對照組稱為輸出組。

內(nèi)源性 Co-IP 實驗用于驗證兩種蛋白質(zhì)是否具有已知作用。如果*終結(jié)果是肯定的，則可以證明兩種蛋白質(zhì)之間存在相互作用；但如果結(jié)果是否定的，則不能證明這兩種蛋白質(zhì)具有已知作用。它們之間沒有相互作用，也可能是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)低引起的。因此，在進(jìn)行內(nèi)源性 Co-IP 驗證兩種蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用時，建議您先表達(dá) Co-IP 作為對照。

免疫沉淀結(jié)果的真實性

為保證免疫沉淀實驗中實驗結(jié)果的真實性，應(yīng)注意以下幾點：

免疫共沉淀技術(shù)應(yīng)用

免疫共沉淀實驗可用于：

隨著蛋白質(zhì)研究的深入，人們將免疫沉淀法與其他方法結(jié)合起來，并在此基礎(chǔ)上衍生出許多更為復(fù)雜的技術(shù)，使得分析方法更加多樣化，其應(yīng)用范圍也相當(dāng)廣泛。免疫共沉淀是一種用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)，可應(yīng)用于蛋白質(zhì)復(fù)合物的研究?？梢则炞C蛋白質(zhì)復(fù)合物的存在，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)復(fù)合物；免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合免疫印跡或質(zhì)譜等方法，用于確定誘餌蛋白與靶蛋白在自然狀態(tài)下的結(jié)合，確定特定蛋白的新作用伙伴。免疫共沉淀實驗也可應(yīng)用于低豐度蛋白質(zhì)的富集和濃縮。

同時，免疫沉淀技術(shù)是一種比較經(jīng)典的探索蛋白質(zhì)間相互作用的技術(shù)，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用和較高的可信度。蛋白質(zhì)之間的相互作用滲透到體內(nèi)每一個細(xì)胞的生命活動中。生物學(xué)中的許多現(xiàn)象，如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪切、分泌、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、中間代謝等，都受到蛋白質(zhì)相互作用的影響。交互調(diào)節(jié)。有些蛋白質(zhì)由多個亞基組成，蛋白質(zhì)之間的相互作用尤為常見。其他蛋白質(zhì)結(jié)合得非常緊密；而其他人只有短暫的互動。然而，無論發(fā)生什么樣的情況，它們都控制著大量的細(xì)胞生命活動，如細(xì)胞增殖、分化和死亡。并且通過蛋白質(zhì)之間的相互作用，可以改變蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)特性，如底物結(jié)合特性、催化活性，也可以產(chǎn)生新的結(jié)合位點，從而改變蛋白質(zhì)對蛋白質(zhì)的特異性?；|(zhì)。它可以滅活其他蛋白質(zhì)并調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。因此，只有讓蛋白質(zhì)之間的相互作用順利進(jìn)行，才能保證細(xì)胞的正常生命活動。由于蛋白質(zhì)之間的相互作用具有如此重要的意義，對其檢測方法的研究也備受關(guān)注和關(guān)注。從此，關(guān)于蛋白質(zhì)之間關(guān)系的研究將越來越激烈。在將來，

其他交互檢測方法