1970 年代發(fā)現(xiàn)了信使核糖核酸 (mRNA) 的 5' 端帽 (m7GpppN)。它的存在賦予 mRNA 穩(wěn)定性并實現(xiàn)高效翻譯。隨著COVID-19在全球肆虐，mRNA療法已成為生物醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的一顆“新星”。我們進一步探索了mRNA 5'端帽結(jié)構(gòu)的生物學功能和應(yīng)用。

在真核細胞中，5'端帽結(jié)構(gòu)除了識別蛋白質(zhì)合成的起始外，還作為5'到3'核酸外切酶切割的保護基團，也募集蛋白質(zhì)因子進行前體mRNA剪接。作為多聚腺苷酸化和核輸出的唯一標識符，它還可以作為招募起始因子的錨點。

在病毒與固有免疫的博弈中，即使是5'端帽結(jié)構(gòu)也極為重要。由于先天免疫系統(tǒng)對沒有 5' 帽結(jié)構(gòu)的 RNA 具有高度敏感性，因此許多病毒已經(jīng)進化出豐富多樣的加帽策略。對這些病毒mRNA加帽機制的研究，開發(fā)了高效的體外RNA加帽系統(tǒng)和mRNA自擴增技術(shù)，極大地促進了科學和治療性mRNA的規(guī)模化生產(chǎn)。此外，RNA 加帽酶的應(yīng)用也使得微生物轉(zhuǎn)錄組的測序和量化成為可能。

圖1. mRNA的分子生物學結(jié)構(gòu)

mRNA 是指導蛋白質(zhì)合成的模板和遺傳物質(zhì)的臨時副本。它具有拷貝數(shù)少、壽命短、修改元件少等特點。成熟真核mRNA的主要序列為編碼區(qū)（圖1），非編碼區(qū)上游5'側(cè)和下游3'側(cè)分別含有帽結(jié)構(gòu)和poly(A)尾結(jié)構(gòu)（圖1）） 2）@) >。

真核生物中mRNA的加帽過程需要多種加帽酶的參與。如圖3所示，RNA三磷酸酶（TPase）從5'-三磷酸中去除γ-磷酸生成5'-二磷酸RNA（反應(yīng)1）。RNA鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶（GTase）通過賴氨酸-GMP共價中間體轉(zhuǎn)移GMP 基團從 GTP 到 5'-二磷酸（反應(yīng) 2.1 和 2.2）@>。嘌呤-N7 甲基轉(zhuǎn)移酶（鳥嘌呤-N7 MTase）在鳥嘌呤的 N7 胺上添加一個甲基cap 形成一個基本的帽結(jié)構(gòu)（Cap0） (reaction 3）.

此外，m7G特異性的2'O-甲基轉(zhuǎn)移酶（mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase）也可以將核糖2'O位置的核糖核苷酸甲基化形成Cap1結(jié)構(gòu)（反應(yīng)4）。*近的研究表明， Cap1 不僅與翻譯起始有關(guān)，而且還是先天免疫系統(tǒng)中針對外來 RNA 的自身 RNA 的標志物。

圖2. 真核生物中mRNA的帽結(jié)構(gòu)類型

圖3. 真核生物中的mRNA加帽過程

5'帽結(jié)構(gòu)在mRNA的質(zhì)量控制中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)報道，在哺乳動物細胞中，存在具有脫帽酶、焦磷酸水解酶和 5' 到 3' 核酸酶活性的三功能蛋白 DXO/Dom3Z。該酶特異性地將未甲基化的帽結(jié)構(gòu)（GpppN）脫帽，將其降解為5'-單磷酸RNA，從而達到質(zhì)量控制的目的。

5'帽結(jié)構(gòu)有助于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。在早期，人們認為 RNA 加帽只發(fā)生在細胞核中。據(jù)報道，在哺乳動物細胞和錐蟲的細胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了 RNA 加帽。真核細胞在 P 體中以信使核糖核蛋白 (mRNP) 的形式維持未加帽的 mRNA 細胞質(zhì)池，在那里可以發(fā)生 mRNA 儲存、去腺苷酸化和脫帽。P-body 中未加帽的 mRNA 可以重新進入 polysome 并被翻譯。細胞質(zhì)重述結(jié)構(gòu)可能代表了一種新的 mRNA 失活-再激活機制，有助于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。

鑒于 RNA 帽結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)翻譯和先天免疫中起著重要作用，病毒已經(jīng)進化出一種生物系統(tǒng)，其中 RNA 添加帽結(jié)構(gòu)以合成病毒蛋白質(zhì)并逃避宿主細胞的先天免疫系統(tǒng)。由于大多數(shù)細胞中的 RNA 加帽位點在細胞核中，因此在細胞質(zhì)中復制的病毒會產(chǎn)生自己的 RNA 帽結(jié)構(gòu)。它們要么合成自己的 RNA 帽結(jié)構(gòu)，要么直接從宿主的 mRNA 中獲取。

一些病毒加帽酶整合了 RNA 加帽（多功能加帽酶）所需的所有酶活性，以在單個多肽中生成 Cap0 或 Cap1。痘病毒加帽酶和藍舌病毒加帽酶就是兩個這樣的例子，它們的全長蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析（圖4）：

圖4.痘病毒加帽酶和藍舌病毒加帽酶結(jié)構(gòu)

痘病毒加帽酶結(jié)構(gòu)和生化數(shù)據(jù)表明 D12 與鳥嘌呤-N7 MTase 結(jié)構(gòu)域的相互作用誘導了有效催化所需的構(gòu)象變化。痘病毒加帽酶的三種酶活性從 N 端到 C 端按照 TPase、GTase 和 Guanine-N7 MTase 的順序整齊地排列成離散的模塊。藍舌病毒加帽酶 VP4 整合了所有四種酶活性以生成 Cap1 結(jié)構(gòu)。

病毒除了合成自身的帽結(jié)構(gòu)外，還奪取宿主的mRNA帽結(jié)構(gòu)（圖5）。在流感病毒（（-）ssRNA）中，依賴RNA的RNA聚合酶（RdRp）是三種蛋白質(zhì)的復合物：聚合酶堿性蛋白 1（PB1），聚合酶堿性蛋白 2（PB2）@> 和聚合酶酸性蛋白 (PA)）。

在細胞核中組裝后，PB2 亞基與宿主 RNA 的帽結(jié)構(gòu)結(jié)合。PA 核酸內(nèi)切酶將切割包括宿主 mRNA 帽結(jié)構(gòu)在內(nèi)的 10-15 個核苷酸，然后將其用于病毒 mRNA 的轉(zhuǎn)錄。在酵母全病毒中，Gag 蛋白從宿主 RNA 上切割 m7GMP 基團并形成組氨酰-m7GMP 共價中間體。然后 m7GMP 基團被共轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)移到病毒轉(zhuǎn)錄物的 5'-二磷酸。這一過程與經(jīng)典 GTase 活性的相似性表明，整個病毒的帽結(jié)構(gòu)與真核生物的加帽機制之間存在進化聯(lián)系。

圖5. 病毒直接獲取宿主的帽子結(jié)構(gòu)

病毒因其添加 mRNA 帽的特殊方式而受到關(guān)注。人們還發(fā)現(xiàn)他們的 RNA 加帽酶具有廣泛的應(yīng)用：

1. 外源mRNA技術(shù)

作為蛋白質(zhì)合成的模板，將mRNA導入細胞是驅(qū)動細胞內(nèi)靶蛋白表達*直觀的方式。外源 mRNA 在干細胞重編程、疫苗接種和治療蛋白的表達中起著關(guān)鍵作用。

2. 功能性mRNA的酶促合成

為避免攜帶動物或病毒材料，*好在體外使用非動物來源的材料，以酶促產(chǎn)生治療性 RNA。通常，依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶將含有啟動子的 DNA 模板轉(zhuǎn)錄成 RNA。RNA 的酶促加帽通常使用痘病毒加帽酶進行，該酶允許對 RNA 進行完全加帽以產(chǎn)生具有 Cap0 的 RNA。

在先天免疫反應(yīng)*小化的應(yīng)用中，可以使用帽特異性 2'O-甲基轉(zhuǎn)移酶將 Cap0 結(jié)構(gòu)進一步修改為 Cap1。在轉(zhuǎn)錄中分別使用 m5CTP 和假尿苷三磷酸代替 CTP 和 UTP，已被證明可以降低 TLR 誘導的免疫反應(yīng)。

3. mRNA 疫苗

與傳統(tǒng)的減毒活的完整生物體相比，通過 mRNA 疫苗接種的疫苗接種具有許多積極的屬性。mRNA疫苗不僅不會對載體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，而且是刺激先天免疫和體液免疫的有效手段。制造非常簡單，一旦獲得致病因子的基因組序列，就可以迅速做出反應(yīng)。與DNA疫苗不同，由于mRNA疫苗可以在細胞質(zhì)中直接翻譯，因此產(chǎn)生抗原的反應(yīng)時間更快、更有效。無需擔心潛在的基因組整合。

4. 自擴增 mRNA

使用 alphavirus 的 RNA 轉(zhuǎn)錄加帽裝置，已開發(fā)出一種自擴增 mRNA 技術(shù)作為疫苗接種的原位基因表達載體。Alphavirus 有一個 (+) ssRNA 基因組，它編碼用于 RNA 依賴性 RNA 復制、轉(zhuǎn)錄和加帽的非結(jié)構(gòu)前體蛋白 nsp1-4，以及兩個衣殼蛋白 E2 和 E1。

通過用靶基因替換衣殼蛋白基因，加帽和聚腺苷酸化的自擴增 RNA 構(gòu)建體在引發(fā)免疫反應(yīng)方面比通過標準 mRNA 接種疫苗更有效，并且已在動物模型中被證明是有效的。

5. Capable-Seq RNA 測序

痘病毒加帽酶可以使用 3' 修飾的 GTP 為 RNA 添加帽結(jié)構(gòu)。因此，出現(xiàn)了一種基于該功能的從生物樣品中富集和確定 5'-三磷酸 RNA 種類的新方法。稱為 Cappable-seq，痘病毒加帽酶用于使用 3'-脫硫生物素 GTP 來加帽生物樣品中 RNA 的 5'-三磷酸或二磷酸末端。然后可以對脫硫的生物素化加帽 RNA 進行富集和深度測序。

Cappable-seq 實現(xiàn)了初級轉(zhuǎn)錄本的 50 倍富集，并在整個基因組中以單堿基分辨率在大腸桿菌中鑒定了一個以前未報告的轉(zhuǎn)錄起始位點 (TSS)。該方法還被應(yīng)用于從小鼠盲腸樣本中鑒定微生物組轉(zhuǎn)錄組mrna是蛋白質(zhì)翻譯的模板，并首次在微生物組中鑒定出 TSS。

當前現(xiàn)有的封頂方法：

1.酶法mRNA加帽

痘苗病毒加帽酶在RNA的5′端添加7-甲基鳥苷帽結(jié)構(gòu)（m7Gppp，Cap0）。在真核生物中，該結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)運和翻譯密切相關(guān)。該系統(tǒng)通常包含三種酶（RNA三磷酸酶、鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶、鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶）；它們都是添加完整的Cap 0結(jié)構(gòu)m7Gppp5'N所必需的。近岸蛋白生產(chǎn)的加帽酶可以使用T7 RNA聚合酶生產(chǎn)的RNA的加帽反應(yīng)， GMP級（GMP-E121，Novoprotein）反應(yīng)，加帽反應(yīng)在一小時內(nèi)完成，加帽效率接近100%mrna是蛋白質(zhì)翻譯的模板，所有帽結(jié)構(gòu)都按正確的方向添加。這與共轉(zhuǎn)錄法添加不同帽類似物。

2.帽結(jié)構(gòu)類似物的共轉(zhuǎn)錄和加帽

抗抗帽結(jié)構(gòu)類似物 (ARCA) [抗抗抗帽結(jié)構(gòu)類似物 3'-O-Me-m7G(5') ppp(5')G] 是用于共轉(zhuǎn)錄加帽的首選帽結(jié)構(gòu)類似物. 由于 ARCA 是針對共轉(zhuǎn)錄的，N7-甲基鳥苷位于 [m7G(5')pppG-RNA] 的末端，因此它可以產(chǎn)生 100% 可翻譯的加帽轉(zhuǎn)錄本。

標準帽結(jié)構(gòu)類似物[標準帽結(jié)構(gòu)類似物m7G(5')ppp(5')G]可以在兩個方向整合[m7G(5')pppG-RNA]或[G(5')pppm7G-RNA]產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本作為混合物。如果帽結(jié)構(gòu)類似物以錯誤的方向摻入到 mRNA 中，它就不能被有效翻譯，導致目標蛋白的產(chǎn)量低。如果RNA產(chǎn)物是5'-加帽和5'-三磷酸的混合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，則需要純化或用磷酸酶處理，以避免5'-三磷酸RNA的免疫原性。

3.Cap 1 裝飾

研究表明cap 1結(jié)構(gòu)可以提高mRNA的翻譯效率，從而增加mRNA在轉(zhuǎn)染和顯微注射實驗中的表達。以近岸蛋白為例，其 Cap 1 Capping System 可以使用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體，對加帽的 RNA（cap 0） 獲得 cap 1 結(jié)構(gòu)）進行甲基化。

綜上所述，mRNA的帽結(jié)構(gòu)與RNA的質(zhì)量控制和機體的先天免疫有著重要的關(guān)系。同時，與加帽相關(guān)的病毒加帽相關(guān)酶也受到關(guān)注。加帽酶在外源mRNA技術(shù)、功能性mRNA的酶促合成、mRNA疫苗、自擴增mRNA和Cappable-Seq RNA測序等方面具有良好的應(yīng)用前景。

參考文獻：AnandRamanathan, G. Brett Robb, Siu-Hong Chan, mRNA capping: biofunctionals and Applications, Nucleic Acids Research, Volume 44, Issue 16, 19 September 2016, Pages 7511–7526,