體外轉(zhuǎn)錄/翻譯 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯一、基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯的意義二、基因體外轉(zhuǎn)錄的原理及操作三、基因體外轉(zhuǎn)錄的應用< @四、基因體外翻譯的原理和操作五、基因體外轉(zhuǎn)錄和基因翻譯一、基因體外轉(zhuǎn)錄和基因翻譯程序繁瑣。體外操作。體內(nèi)操作研究蛋白質(zhì)和RNA方便。它需要快速方便地獲取蛋白質(zhì)和 RNA。基因的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。DNA模板啟動子、結(jié)構基因轉(zhuǎn)錄終止子RNA聚合酶四種核糖核酸轉(zhuǎn)錄因子基因體外轉(zhuǎn)錄翻譯< @二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理及操作1、基因體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程真核基因轉(zhuǎn)錄原核基因轉(zhuǎn)錄基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理及操作2、基因體外轉(zhuǎn)錄的原理 基本工作原理是以DNA為模板，在轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中一系列轉(zhuǎn)錄因子的作用下，通過RNA聚合酶合成RNA?；蝮w外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由 PELHAM 和 JACKSON 于 1976 年建立。體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)已逐漸成熟?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理及操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄操作（1） RNA聚合酶（RNA Polymerases） 常用的聚合酶是來源于噬菌體的RNA聚合酶T7、SP6、T3特異性識別模板啟動子，其轉(zhuǎn)錄效率高于大腸桿菌聚合酶。酶的來源和質(zhì)量高?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯二、基因體外轉(zhuǎn)錄原理及操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄操作（1）

為了確定病毒在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯的侵襲性基因，核酶核酶是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的RNA分子，可以特異性切割靶RNA序列。Hammerhead ribozyme 發(fā)夾核酶基因體外轉(zhuǎn)錄翻譯1、基因體外翻譯過程<@四、基因體外翻譯原理及操作2、基因體外翻譯原理 細胞游離蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)是以外源mRNA或DNA為模板，通過補充細胞提取物酶系統(tǒng)中的底物和能量物質(zhì)來合成蛋白質(zhì)的體外系統(tǒng)。與傳統(tǒng)的體內(nèi)重組表達系統(tǒng)相比，體外無細胞合成系統(tǒng)具有諸多優(yōu)勢，如表達對細胞有毒性作用或含有非天然氨基酸（如D-氨基酸）的特殊蛋白質(zhì)，可直接以PCR產(chǎn)物為模板，同時并行合成多種蛋白質(zhì)，進行高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學研究。基因的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（1）兔網(wǎng)織紅細胞裂解物網(wǎng)織紅細胞是從紅細胞分化而來的mrna能夠作為翻譯的直接模板，主要負責用于體內(nèi)合成大量血紅蛋白（90%以上）和球蛋白。開展高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學研究?；虻捏w外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（1）兔網(wǎng)織紅細胞裂解物網(wǎng)織紅細胞是從紅細胞分化而來的，主要負責用于體內(nèi)合成大量血紅蛋白（90%以上）和球蛋白。開展高通量藥物篩選和蛋白質(zhì)組學研究?；虻捏w外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（1）兔網(wǎng)織紅細胞裂解物網(wǎng)織紅細胞是從紅細胞分化而來的，主要負責用于體內(nèi)合成大量血紅蛋白（90%以上）和球蛋白。

這種未成熟的紅細胞本身沒有細胞核，但保留了這種高效翻譯各種核酸信息的能力，可以減少背景，即使在較低豐度下也能更有效地合成產(chǎn)物。根據(jù)測定，體外合成外源蛋白的效率接近完整網(wǎng)織紅細胞自身合成內(nèi)源蛋白的效率。此外，網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)中很少有內(nèi)源性核酸酶，有助于長鏈RNA（包括帶帽或不帶帽的RNA）的穩(wěn)定性，因此可以合成更大的蛋白質(zhì)。網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)是*有前途的微粒體糖基化系統(tǒng)?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯的原理與操作3、

通過添加犬微粒體膜，可以實現(xiàn)信號肽切除和蛋白質(zhì)糖基化等翻譯后加工事件?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯原理及操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（1）兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)體外翻譯系統(tǒng)真核體外 應用*廣泛的翻譯系統(tǒng)之一，常用于較大mRNA種類的鑒定、基因產(chǎn)物特性的分析、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的研究以及共翻譯加工的研究。體外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯原理與操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（< @2）小麥胚芽提取物小麥胚芽提取物是通過研磨小麥胚芽，離心去除細胞殘留物，上清液通過層析分離出抑制翻譯的內(nèi)源氨基酸和植物色素。提取物經(jīng)微球菌核酸酶處理，破壞內(nèi)源性mRNA，大大降低翻譯背景。能量產(chǎn)生系統(tǒng)和磷酸肌酸激酶被添加到提取物中。亞精胺以增加擴鏈效率mrna能夠作為翻譯的直接模板，并加入一定量的醋酸鎂。小麥胚芽提取系統(tǒng)可以穩(wěn)定表達兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)中某些翻譯受抑制的DNA基因?；虻捏w外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（<

由于內(nèi)源性mRNA很少，因此該系統(tǒng)可用于各種病毒、酵母、高等植物甚至哺乳動物的蛋白質(zhì)合成。當表達產(chǎn)物與球蛋白（12-15kD）難以區(qū)分時，或者表達產(chǎn)物可能只是一種蛋白質(zhì)，如哺乳動物細胞中豐富但植物中沒有的調(diào)節(jié)因子，或者當它不能表達時不明原因。試試麥芽提取系統(tǒng)。但是請記住，該系統(tǒng)需要 RNA 具有帽結(jié)構才能更好地翻譯。如果以上條件不能對RNA加帽，就得用大腸桿菌系統(tǒng)基因體外轉(zhuǎn)錄翻譯<@四、基因體外翻譯原理及操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（3）@ > 細菌提取coliCell-Free System 原核系統(tǒng)主要使用大腸桿菌提取物進行表達。使用大腸桿菌系統(tǒng)進行體外表達，某些蛋白質(zhì)每小時每個反應（50ul）可能高達數(shù)百微克。在優(yōu)化的批量系統(tǒng)中，*終的蛋白質(zhì)產(chǎn)量也有可能達到 1mg/ml，而這個產(chǎn)量可以通過連續(xù)反應器進一步提高。人們可以根據(jù)需要添加蛋白酶抑制劑、分子伴侶、代謝物、非天然氨基酸甚至非天然氨基酸等特殊添加劑。也可以將少量的變性劑摻入特殊標記的氨基酸中，以獲得標記的蛋白質(zhì)。這樣一來，這個系統(tǒng)的靈活性就非常大了，還可以加入很多其他優(yōu)化的成分來提高收率，提高溶解度。大腸桿菌的原料來源成本*低，實用性強，表達效率高。基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯原理及操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（3）@>細菌提取物coliCell-Free System s30原核大腸桿菌s30提取物體外翻譯系統(tǒng)的E.coli B菌株是由OmpT內(nèi)切蛋白酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制備的，因此在s30系統(tǒng)中表達基因可以增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性，特別適合蛋白酶體外表達。降解的蛋白質(zhì)。

s30體外翻譯系統(tǒng)也適用于表達那些在體內(nèi)表達時由于宿主編碼的抑制性酶而導致表達水平較低的蛋白質(zhì)，使它們可以高水平表達。s30 系統(tǒng)還可用于轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控的研究。此外，s30體外翻譯系統(tǒng)的應用還包括形成少量標記蛋白作為蛋白質(zhì)純化中的示蹤劑，以及在蛋白質(zhì)中摻入非天然氨基酸用于蛋白質(zhì)的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯研究結(jié)構和功能基因<@四、基因體外翻譯的原理和操作3、基因體外轉(zhuǎn)錄和翻譯<@四、 該序列位于 AUG 上游，與 30S 核糖體亞基的 16s rRNA 序列互補 保守區(qū) 5′-UAAGGAGGUGA-3′，核糖體結(jié)合位點 RBS 與起始密碼 AUG 之間的距離，堿基組成有顯著影響翻譯效率。設計時要注意。

真核生物中的保守序列成為 Kozak 序列 (5′-GCCACCAUGG-3′)。對于高效的翻譯，+1G 和-3A 非常重要。然而，如果 mRNA 沒有這個 Kozak 序列并且具有適當?shù)?5′UTR 長度，它也可以在無細胞系統(tǒng)中有效翻譯?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯<@四、基因體外翻譯原理及操作3、基因體外翻譯系統(tǒng)（5）基因體外轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄鏈接 基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯應用1、基因產(chǎn)物檢測是目前*常見的應用，獲得DNA序列后，通過起始密碼子ATG（少數(shù)情況下為GTG）和終止密碼子（TAA、TAG） . 或 TGA) 初步判斷為開放閱讀框 (ORF)。使用快速體外表達可以快速判斷序列是否有表達產(chǎn)物、表達產(chǎn)物特征等第一手信息。這種方法對于一次檢測多個 ORF 產(chǎn)品特別有用 方便?；蝮w外轉(zhuǎn)錄和翻譯五、基因體外翻譯的應用 預合成的高通量蛋白表達和純化通常在體外表達后體內(nèi)表達，因為體外表達可以表達一些強毒性、敏感性水解或不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。此外，體外表達的另一個優(yōu)點是在合成過程中可以插入具有光敏性、熒光性或生物素殘基的標記，以促進蛋白質(zhì)定位。

基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯應用高通量篩選?篩選病毒特異性翻譯抑制復合物?篩選分子伴侶抑制劑以識別新的孤兒受體基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯的應用 膜蛋白研究 已有實驗證明，在體外表達系統(tǒng)中加入犬微粒體膜，可以讓跨膜蛋白G蛋白偶聯(lián)受體正確折疊。添加非天然氨基酸進行標記實驗表明，帶有賴氨酸反密碼子的修飾tRNA可以將非天然氨基酸插入體外表達的合成多肽中。聚合物組裝基因的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯 < @五、 基因體外翻譯應用蛋白質(zhì)截斷試驗（Protein truncation test，PTT） 這個實驗發(fā)明于1993年，可以快速檢測基因突變?；蝮w外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯應用功能基因組學?體外表達克隆核糖體展示、RD基因體外轉(zhuǎn)錄與翻譯五、基因體外翻譯應用酶活性分析部分蛋白仍表達體外 保持活性，因此這些樣品可用于酶活性測定。如果體外表達系統(tǒng)中所含的酶活性與待測酶不同，則表達產(chǎn)物可不經(jīng)純化直接進行檢測。此外，可以方便地將一些外部因素加入到體外表達系統(tǒng)中，

翻譯后修飾分析 許多蛋白質(zhì)在形成和發(fā)揮功能之前需要進行高級修飾。目前，已經(jīng)在兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)中成功地進行了過度磷酸化、腺苷酸化、肉豆蔻?；?、法呢化、異戊二烯化和蛋白水解活性修飾。額外的微粒體膜可用于研究糖基化、甲基化和信號序列去除?；蝮w外轉(zhuǎn)錄和翻譯五、 基因體外翻譯蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的應用。這些作用包括特異性結(jié)合（例如抗原-抗體、配體-受體結(jié)合）、大分子組裝和轉(zhuǎn)錄功能復合物的形成。通常相互作用蛋白分別通過體內(nèi)表達系統(tǒng)和體外表達系統(tǒng)表達，體外表達可以方便地標記蛋白質(zhì)，并作為探針檢測另一種蛋白質(zhì)。該方法也可用于驗證酵母雙雜交的結(jié)果。蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-RNA相互作用表達的蛋白質(zhì)可以通過電泳遷移率變化分析（EMSA）來發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)是否可以與核酸結(jié)合，結(jié)合的蛋白質(zhì)會移動得更慢。DNA-RNA 和 RNA-RNA 與互補核酸序列的相互作用會抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯的進程?；虻捏w外轉(zhuǎn)錄和翻譯，課后復習1、體外轉(zhuǎn)錄常用的RNA聚合酶2、體外轉(zhuǎn)錄模板DNA的來源和要求3、體外翻譯常用的翻譯系統(tǒng)4、